Progetto BiLiGeCT

Il progetto beneficiaria di agevolazione a valere su Avviso per la presentazione di progetti di Ricerca Industriale e Sviluppo Sperimentale nelle 12 aree di specializzazione individuate dal PNR 2015 - 2020" - Decreto Direttoriale 13 luglio 2017 n. 1735 codice progetto n. ARS01_00492, dal titolo "Biopsie liquide per la gestione clinica dei tumori" (BiLiGeCT), (www.ponricerca.gov.it) 01.07.2019 -31.12.2022, prevedeva 5 linee di ricerca per lo sviluppo di marcatori circolanti, mediante biopsia liquida, per la prevenzione, diagnosi e terapia dei tumori sia ereditari che sporadici:

1. diagnosi precoce di malattia in soggetti sani BRCA mutati a rischio genetico di tumori della mammella/ovaio per lo sviluppo di saggi diagnostici altamente sensibili ed economici;

   Lo scopo di questo primo obiettivo rappresenta quello che è il campo più avanzato della diagnostica in campo oncologico: l’identificazione estremamente precoce della presenza di un tumore con una metodologia sufficientemente sensibile e specifica e non invasiva e, come tale, applicabile ad una popolazione di soggetti sani. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, di cui non sfugge portata e difficoltà, abbiamo pensato di concentrare la nostra attenzione su una coorte di individui, quelli a rischio genetico, in particolare portatori di mutazioni BRCA1 o 2, che, rispetto ad un approccio riguardante la popolazione generale, hanno due vantaggi sperimentali: sono ad alto rischio di sviluppare un tumore (pertanto sono inclusi in programmi di follow up più intensivi di quelli adottati per la popolazione generale) ed inoltre, quale significativo vantaggio per le analisi molecolari, possiamo prevedere quali tumori insorgeranno nel tempo, nello specifico, carcinomi della mammella e/o ovaia. Con questa premessa, l’obiettivo principale di questa linea di ricerca è stato la realizzazione di una biobanca di plasma raccolto da famigliari sani di soggetti mutati con tumore al seno/ovaia e a loro volta positivi per la stessa mutazione in uno dei due geni BRCA. Questa collezione di campioni (che attualmente consiste in 20 campioni di plasma, ottenuti da 16 individui in programmi di sorveglianza attiva perchè ad alto rischio, e che verrà ulteriormente implementata) è di un valore straordinario in quanto una volta occorso l’evento malattia in un soggetto in follow up, si potrà condurre un’analisi molecolare retrospettiva per valutare quanto anticipatamente la biopsia liquida ha potuto intercettare la malattia rilevabile strumentalmente o clinicamente. Oltre ad una particolare attenzione agli sviluppi tecnologici, che verranno nel frattempo prodotti dalla ricerca in campo della biopsia liquida, le metodologie che verranno impiegate, in quanto al momento nessun soggetto in follow up ha sviluppato un tumore, saranno quelle derivate dalle ricerche descritte nella linea di ricerca successiva, in particolare,quelle derivate dallo sviluppo del "protocollo olistico" come strumento utile per raggiungere il presente obiettivo. Propedeutiche e in parallelo all’attività di raccolta dei campioni, qui descritta, sono stati messi a punto tutti i protocolli necessari per la massimizzazione della resa del DNA circolante (cfDNA) presente nei campioni di sangue venoso, attraverso anche la preparaziione del plasma dagli stessi. Per la gestione dei casi raccolti, della registrazione delle loro caratteristiche cliniche e, dove effettuate, delle relative analisi molecolari, è stato sviluppato ad hoc un data base. La realizzazione di queste due ultimi aspetti del progetto, hanno, inoltre, consentito l’attivazione di quanto previsto nella successiva linea di ricerca.

2. diagnosi precoce di ripresa di malattia in soggetti BRCA mutati con storia pregressa di tumore della mammella/ovaio in sorveglianza con l’impiego di marcatori circolanti per monitorare la malattia e l’adeguato uso della terapia;

   Con questo obiettivo si è voluto testare la corrispondenza tra profilo molecolare, determinato attraverso un sequenziamento "next generation sequencing" (NGS) dell’intero esoma (NGS/WES) del tumore analizzato e quanto rilevabile nel rispettivo ctDNA presente in circolo. Lo step iniziale ha visto un sequenziamento NGS/WES di un totale di piu’ di 50 tumori e del rispettivo tessuto normale. Questa analisi che ha riguardato tumori del seno e dell’ovaia e con diverse mutazioni in BRCA1 o 2, ha anche permesso di ottenere rilevanti informazioni sul profilo mutazionale di questi tumori che sono stati utilizzati per disegnare un pannello proprietario in grado di intercettare, mediante sequenziamento NGS, la maggioranza dei tumori di questo tipo. Questo pannello genico costituisce un elemento di un protocollo, prodotto nel progetto, da noi definito "olistico" che unisce, per lo stesso campione, analisi genetiche, epigenetiche e sfruttanti le proprietà chimico/fisiche del DNA. Di paricolare rilievo è stata l’analisi della fattibilità di un’analisi epigenetica del metiloma e del frammentoma che hanno richiesto lo sviluppo di specifici tool bioinformatici, validati, in via preliminare, con dati disponibili in data base pubblici. Con il "pannello olistico" si sono ottenuti primi dati di sensibilità che indicano la sua fattibilità ad essere impiegato come strumento analitico del ctDNA ottenuto da biopsia liquida.I risultati ottenuti dalle analisi molecolari di questa significativa serie di tumori BRCA mutati sono in via di formalizzazione per una pubblicazione scientifica.

3. diagnosi precoce di tumori di polmone e prostata per lo sviluppo di nuovi marcatori esosomiali circolanti per una diagnosi di malattia più efficace e meno invasiva;

   Nell’ambito del Progetto, sono stati valutati numerosi marcatori molecolari potenzialmente in grado di individuare o monitorare i tumori della prostata, del polmone e del colon, differenziare le forme più aggressive e suggerire terapie mirate. È stata eseguita l’analisi del contenuto molecolare (proteine, frammenti di DNA e RNA) di nano-vescicole (esosomi) rilasciate dai diversi tumori, che rappresentano il tessuto di origine e, di conseguenza, le aberrazioni del tumore. Sono stati processati e analizzati oltre 150 campioni di esosomi, in pazienti con tumore della prostata, del polmone e del colon. Inoltre, mediante una tecnica innovativa, la Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), che consente l’analisi delle singole vescicole extracellulari grazie alla microscopia a super-risoluzione, sono stati esaminati numerosi casi valutando l’espressione delle proteine vescicolari con una risoluzione capace di discriminare la singola molecola. I dati preliminari dimostrano come alcuni marcatori presenti sulla superifice e all’interno del lume delle vescicole, siano significativamente più espressi nelle vescicole isolate dal sangue dei pazienti con tumori della prostata rispetto a quelle isolate dai pazienti con iperplasia prostatica benigna. Queste differenze potrebbero permettere una diagnosi precoce più accurata e sensibile rispetto alle procedure ad oggi effettuate tramite i biomarcatori convenzionali come il PSA. In maniera similare, per i pazienti con il tumore al colon localmente avanzato, sono state identificate delle proteine vescicolari che potrebbero essere associate alla prognosi dei pazienti in trattamento con terapia convenzionale o immunoterapia. Lo studio ha dimostrato di essere tecnicamente applicabile anche ai tumori del polmone, dove l’unica opportunità di diagnosi precoce è offerta dalla TAC a bassa dose che, pur rappresentando una metodica efficace, è certamete costosa e di difficile accesso. I risultati del progetto suggeriscono che la caratterizzaizone delle proteine vescicolari attraverso metodiche semplici e non invasive, potrebbero rappresentare, in futuro, una valida alternativa per lo screening di queste malattie oncologiche.

4. scelta delle terapie di seconda linea ed oltre nei tumori del colon-retto mediante biopsia liquida;

   Nell’ambito del progetto i partner responsabili di questo obiettivo, hanno reclutato i pazienti e hanno raccolto campioni seriali di sangue attraverso prelievo venoso. Successivamente, è stato estratto il DNA dal tumore, poi sottoposto al sequenziamento, e il DNA libero circolante (cfDNA) dai campioni di sangue. Sono poi state effettuate analisi di tipo biomecolare sia sul DNA ottenuto dal tessuto tumorale che sul cfDNA. Le analisi di sequenziamento sono state eseguite attraverso una tecnica nota come Next-generation Sequencing (NGS) e la relativa analisi bioinformatica ha consentito di identificare mutazioni "trunk" (ovvero mutazioni presenti in tutte le regioni del tumore) o "driver" (ovvero mutazioni responsabili del fenotipo tumorale e della eventuale resistenza a terapie a bersaglio molecolare) in specifici geni nel tessuto tumorale del paziente. Attraverso la ddPCR (droplet digital PCR), una tecnica ad elevata sensibilità di quantificazione del DNA, si è proceduto alla ricerca delle medesime mutazioni trunk/driver nel cfDNA degli stessi pazienti. La quantificazione del cfDNA nel sangue attraverso biopsia liquida, in quanto esame diagnostico, non invasivo, altamente sensibile e ripetibile, permette pertanto di seguire l’andamento della malattia e la risposta alle terapie. Per alcuni dei pazienti, inclusi in queste analisi, l’utilizzo della biopsia clinica ha infatti permesso di predire la progressione clinica della malattia. I dati emersi da questo progetto confermano la possibilità di un’applicazione clinica della biopsia liquida per definire la prognosi e il trattamento dei tumori del colon-retto.

5. sviluppo di innovativi test cellulari per lo screening di nuovi farmaci o il riposizionamento di farmaci noti per le mutazioni rilevate con biopsia liquida. Inizialmente, sarà testata la sensibilità ai PARP inibitori di alcune varianti BRCA a significato funzionale ignoto (VUS).

   Questo obiettivo si proponeva due scopi, da un lato voleva contribuire a sviluppare una metodologia che permettesse di valutare funzionalmente il significato delle varianti a significato ignoto (VUS) di geni di predisposizione genetica al cancro,dall’altro di dare risposte alle problematiche legate alle terapie,in particolare quelle utilizzanti i cosidetti PARP inibitori. Questi ultimi basano la loro efficacia sulle presenza di varianti patogenetiche dei geni BRCA e quindi potrebbero identificare VUS responsive da VUS non responsive a questo trattamento. Il problema delle VUS è di particolare rilievo nella consulenza genetica in quanto il riscontro di una tale situazione non consente di dare alcuna diagnosi definitiva. La strategia affrontata da due partner del progetto, ha riguardato per un partner la realizzazione di modelli cellulari ingegnerizzati tramite genome editing (CRISP-cas9) e nel corso dello studio è stato messo a punto un nuovo protocollo ad alta efficienza di trasfezione, per la caratterizzazione funzionale di VUS dei geni BRCA. Con questa metodologia sono state costruite 5 linee cellulari co-isogeniche, la prima definita Linea Parentale (MCF7 BRCAnull/BRCAwt o HAPLO) è stata ottenuta eliminando uno dei due alleli wt di BRCA1. Successivamente, da quest’ultima sono state generate, per inserzione nel residuo locus BRCA1, 5 mutazioni, 3 con classe di patogeneticità nota, 1 neutra ed 1 VUS cioé a significato ignoto. Con questo strumento, rappresentato dalle linee coisogeniche con unica variante le diverse mutazioni BRCA1, sarà poi possibile sperimentare diversi approcci per la definizione funzionale di una VUS. Un’altra linea di ricerca ha invece ottenuto, in diverse linee cellulari cronicamente esposte al farmaco, la conversione del fenotipo suscettibilità ad uno di resistenza al trattamento. Questo approccio, oltre ad evidenziare geni e relativi pathways correlati ai fenomeni di resistenza al farmaco, ha consentito di identificare una serie di molecole con attività "dual" in grado di revertire la resistenza ad Olaparib. Presi nel loro insieme questi risultati indicano chiaramente che il co-targeting di PARP con inibitori di CDK o mTor producono effetti antagonisti. Al contrario, come suggerito dall’attività di Gem122, un dual antagonist di PARP/HDAC, l’associazione di initori di PARP con inibitori HDAC potrebbe avere una rilevanza terapeutica che andrebbe investigata a livello clinico.

Al via BiLiGeCT, il progetto focalizzato sulle Biopsie liquide per la Gestione Clinica dei Tumori che si è aggiudicato un prestigioso finanziamento PON del MIUR. Invecchiamento, malattie croniche e degenerative e qualità della vita: questi i tre fattori che emergono come aree d’intervento prioritarie nell’Area "Salute" nell’Agenda strategica nazionale. Il progetto dal titolo "Biopsie Liquide per la Gestione Clinica dei Tumori" (acronimo: BiLiGeCT), proposto da Cogentech, Società Benefit srl di IFOM, in collaborazione con il Consorzio Interuniversitario Nazionale Metodologie e Processi Innovativi di Sintesi (CINMPIS, che vede coinvolte l’Università degli Studi di Catania e l’Università degli Studi di Messina), l’Istituto Superiore di Sanità (ISS), l’Università di Torino (UniTO), l’Istituto Oncologico del Mediterraneo spa (IOM) e CaReBios srl, si inserisce proprio nell’ambito di queste aree di intervento prioritarie, con il chiaro obiettivo di migliorare la gestione clinica delle malattie oncologiche. Con questo ambizioso obiettivo il progetto BiLiGeCT si è aggiudicato un finanziamento del Programma Operativo Nazionale (PON) Ricerca e Innovazione 2014-2020, gestito dal Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca (MIUR). BiLiGeCT propone una ricerca innovativa volta a sviluppare nuove e superiori soluzioni tecnologiche per migliorare due aspetti di fondamentale importanza, ancorché imperfetti, in campo oncologico: la diagnosi precoce e l’appropriatezza terapeutica.
Relativamente al primo punto, il Progetto si rivolge ad un ambito in crescita, l’emergenza di particolari tipologie di tumori, come conseguenza principale dell’invecchiamento della popolazione, tanto che il tumore viene considerato anche come una malattia dell’invecchiamento, e si basa sul concetto che una diagnosi precoce quasi sempre produce un esito migliore della malattia.
Per quanto riguarda il secondo punto, le terapie oncologiche di nuova generazione, per loro costituzione, tendono al risultato di rendere i tumori malattie croniche come dimostrato dal fatto che per tenere sotto controllo la malattia tumorale è richiesta la continua presenza del farmaco appropriato.
Infine la qualità di vita del paziente oncologico, alla luce del precedente concetto di cronicizzazione della malattia, viene ad assumere un ruolo sempre più rilevante come anche sottolineato dalle Associazioni che riuniscono e danno voce ai pazienti oncologici.
Il Progetto vuole affrontare questi obiettivi utilizzando uno strumento innovativo, la biopsia liquida, che racchiude in sé tutte le premesse per essere considerata una nuova e più efficace arma per la gestione clinica dei tumori. Al concetto tradizionale di biopsia tissutale, quella liquida affianca la minima o nulla invasività del prelievo di liquidi biologici, urina, lavaggi orali o di altre sedi e principalmente sangue, nei quali, con sensibili e sofisticate tecnologie molecolari, vengono ricercati biomarcatori di diversa natura indicativi della presenza di una forma tumorale. Per le sue caratteristiche, la biopsia liquida si presta ai cosiddetti "studi longitudinali" che prevedono il prelievo del materiale biologico da esaminare a tempi diversi durante il programma di sorveglianza clinico-strumentale, proprio per monitorare l’evoluzione dinamica nel tempo della malattia cancro. Questa caratteristica della biopsia liquida la rende, quindi, utile non solo nella diagnosi ma anche nella possibilità di modificare nel tempo la terapia seguendo i cambiamenti molecolari che avvengono durante l’evoluzione nel tempo della malattia.
Attraverso un approccio di biopsia liquida, il Progetto BiLiGeCT vuole, in particolare, rispondere a quesiti ancora aperti nella diagnosi precoce in soggetti ancora sani e con elevato rischio genetico di tumore cioè del tipo eredo-familiare - approccio poi estendibile ai più comuni tumori sporadici – e in una precoce identificazione di ripresa di malattia in soggetti dello stesso tipo con precedente storia tumorale. La biopsia liquida comprende l’analisi di acidi nucleici liberi circolanti DNA, RNA e miRNA, l’analisi di esosomi e di Cellule Tumorali Circolanti (CTC), queste ultime ipotizzate come la popolazione tumorale che porterà alla recidiva del tumore.
La prima linea di ricerca riguarda la diagnosi precoce della malattia con un approccio di biopsia liquida in soggetti sani ma portatori di una mutazione germinale in uno dei due geni BRCA (1 e 2) e pertanto a rischio di tumori alla mammella o all’ovaio, con l’obiettivo di sviluppare uno strumento diagnostico più sensibile, efficace e sostenibile, in termini di costi/benefici, dello screening strumentale ora disponibile.
La seconda linea, come la prima si focalizza sui tumori del tipo eredo-familiare BRCA ma in soggetti con precedente storia tumorale per identificare precocemente la ripresa della malattia e di caratterizzarla molecolarmente per monitorare l’efficacia e l’appropriatezza della terapia.
La terza linea verterà ancora sui temi di diagnosi precoce per mezzo di biopsie liquide con modalità simili a quelle descritte per i tumori eredo-familiari ma orientate alla diagnosi dei tumori del polmone e della prostata con l’obiettivo di rendere le diagnosi di malattia più efficaci e meno invasive, introducendo, inoltre, innovazioni tecnologiche di diagnosi e prognosi molecolare di questi tumori.
La quarta linea di ricerca affronterà il tema della diagnosi precoce soprattutto di ripresa di malattia metastatica e della scelta basata sul profilo molecolare della malattia in evoluzione durante il trattamento di seconda linea ed oltre nei tumori del colon-retto.
La quinta linea di ricerca cercherà di sviluppare un innovativo test cellulare per screening di nuove molecole terapeuticamente attive o il riposizionamento di farmaci già noti per le mutazioni dei geni BRCA e di quegli elementi genetici, che con questi collaborano, nel garantire l’integrità del DNA attraverso i suoi meccanismi di riparo (BRCAness). Questi farmaci, in generale, appartengono alla categoria dei cosiddetti inibitori del sistema enzimatico PARP. Questi inibitori si sono rivelati efficaci non solo per i tumori eredo-familiari con le mutazioni germinali sopra ricordate ma anche per tumori sporadici dello stesso istotipo e con mutazioni somatiche di questi geni. Con questo modello funzionale, sarà anche affrontato il problema posto dalle mutazioni BRCA a significato funzionale ignoto (VUS) che verranno quindi saggiate per la loro sensibilità ai PARP inibitori attivi sui tumori con mutazioni BRCA chiaramente patogenetiche.
L’obiettivo finale del progetto è giustamente ambizioso e si colloca alla frontiera della tecnologia attuale, tuttavia, esso appare attuabile grazie alle infrastrutture ed esperienza pregressa nell’uso di tecnologie innovative dei diversi Enti partecipanti e alle qualificate professionalità in essi disponibili. Inoltre, un indubbio valore aggiunto è dato dalla disponibilità di una coorte di soggetti sani o con già esperienza di malattia tumorale appartenenti alla popolazione a rischio genetico di sviluppare un tumore della mammella e/o ovaio perché portatori di una mutazione germinale di uno dei geni BRCA. Questa opportunità appare unica per gli obiettivi diagnostici della biopsia liquida vuoi perché per una sua caratteristica di precocità è prevedibile "a priori" il tipo di tumore che apparirà, vuoi perché diversi aspetti molecolari dei tumori in oggetto sono ben noti e consentiranno di approntare strumenti di diagnosi molecolare altamente personalizzati per questi pazienti.
Inoltre, con l’approccio di biopsia liquida sarà possibile monitorare l’efficacia in termini di costi/benefici dell’introduzione di queste nuove metodologie diagnostiche.
Il positivo conseguimento degli obiettivi finali del progetto consentirà in prospettiva di introdurre sul mercato sia innovative tecniche di laboratorio che originali saggi diagnostici.

La sede operativa di Cogentech Società Benefit SRL per il progetto BiLiGeCT è presso il Parco Scientifico e Tecnologico della Sicilia, Zona Industriale, Blocco Palma 1, 95121 Catania (CT)

Marco Pierotti, Direttore Scientifico
marco.pierotti[@]cogentech.it

Nina Offenhauser, Project Manager
nina.offenhauser[@]cogentech.it